Plateforme Approche fonctionnelles et Structurales des InterActions cellulaires
(ASIA)


Présentation

La plateforme technologique « Approches fonctionnelles et Structurales des InterActions cellulaires » (ASIA) localisée à la Faculté des Sciences et Technologies a pour mission de favoriser le développement de nouvelles technologies et de mutualiser certains équipements scientifiques. Elle se trouve de fait rattachée au Pôle Scientifique A2F. ASIA a pour vocation, notamment, d’étudier la régulation des activités biologiques et physiologiques des protéines par des ligands, ces derniers pouvant être soit des macromolécules (protéines ou ADN), soit de plus petits composés tels que des peptides, des métabolites secondaires, des glucides, des ions métalliques, etc.


Technologie SwitchSENSE®

Parmi les différents équipements disponibles sur la plateforme ASIA, l’analyseur DRX commercialisé par Dynamic Biosensors (Planegg, Allemagne) en est l’équipement-phare : Il permet d’étudier l’aspect cinétique des interactions moléculaires selon la technologie originale switchSENSE® en mesurant les constantes d’association et de dissociation des complexes moléculaires (kon et koff), ce qui permet également d’accéder à la constante de dissociation KD (koff/kon). Les processus cinétiques d’association et de dissociation de complexes peuvent être deux mécanismes indépendants et l’outil DRX apporte des informations cruciales afin de mieux comprendre les mécanismes des interactions moléculaires. Il peut se révéler complémentaire d’une approche thermodynamique par calorimétrie isotherme à titration (ITC). De plus, la technologie switchSENSE® se démarque des technologies SPR (surface plasmon resonance) de type Biacore et BLI (bio-layer interferometry) de type Octet car, à la différence de ses concurrents, elle permet de déterminer le diamètre hydrodynamique (DH) et la température de fusion (TM) des protéines et d’observer en temps réel les changements conformationnels occasionnés par la fixation d’un analyte.

L’analyseur DRX (Dynamic Biosensors)

L’analyseur DRX (Dynamic Biosensors)


Principe

Le principe de la technologie switchSENSE® est le suivant : Un ligand (protéine) est fixé de manière covalente sur un brin d’ADN qui sera ensuite hybridé avec un autre brin d’ADN déjà fixé sur une biopuce recouverte d’une couche d’or. Ce deuxième brin d’ADN est porteur d’une sonde fluorescente à son extrémité libre.

Fonctionnalisation d’une biopuce (Dynamic Biosensors)

Fonctionnalisation d’une biopuce (Dynamic Biosensors)

Les doubles brins d’ADN ainsi formés oscillent entre la position verticale et la position horizontale sous l’effet d’une tension électrique alternative. Le mouvement de ces « leviers » est suivi en temps réel par mesure de l’extinction (quenching) de fluorescence lorsque la sonde fluorescente se rapproche de la couche d’or et par mesure du temps écoulé pour retrouver pleinement l’énergie de fluorescence lorsque les leviers reviennent en position verticale. L’analyte à tester est, quant à lui, véhiculé dans un circuit microfluidique. Lors de la liaison de l’analyte sur le ligand, le frottement hydrodynamique des leviers est affecté et le temps de restauration de l’intensité de fluorescence est plus long. Ce changement est utilisé par le logiciel du système pour déterminer les différents paramètres.

Mesure dynamique d’une interaction (Dynamic Biosensors)

Mesure dynamique d’une interaction (Dynamic Biosensors)


Domaines d’application

L’analyseur DRX est conçu pour la mesure d’interactions de systèmes variés tels que : protéine-protéine, protéine-peptide, protéine-petite molécule, protéine-ion métallique, protéine-acide nucléique, et acide nucléique-acide nucléique, ce qui en fait un outil très polyvalent.

Etude des interactions moléculaires en temps réel (Dynamic Biosensors)Etude des interactions moléculaires en temps réel (Dynamic Biosensors)


Prestations et conseils pratiques

En premier lieu, prendre contact suffisamment tôt avec le responsable pour étudier la faisabilité du projet, pour déterminer ensemble la stratégie à adopter, le choix du type d’immobilisation, du système de tampons ainsi que le coût et la planification du projet.

Il est important de connaître au préalable les caractéristiques physico-chimiques des deux partenaires, ligand et analyte (masses moléculaires, point isoélectrique de la protéine à greffer sur la biochip, concentrations, solubilité, pureté, valeur du KD, etc.) et les systèmes de tampons compatibles.

Attention, certains composés peuvent être utilisés dans une gamme de concentrations définie par le fournisseur afin qu’ils soient compatibles avec la technologie switchSENSE®. C’est le cas du glycérol, méthanol, DMSO, EDTA, urée, chlorure de guanidine, détergents non ioniques, agents réducteurs, certains lipides…

Lorsque le greffage de la protéine-ligand est réalisé par couplage amine, il est important que la protéine ne soit pas préparée dans du tampon contenant des amines primaires. Le Tris doit donc être évité dans ce cas. Le tampon PBS est conseillé.

Pour une conjugaison par couplage amine, la concentration de la protéine doit être de 100 à 200 µg pour un volume de 50 µL. Pour l’analyte à tester, une solution-mère à 100 µM est à préparer dans le tampon préalablement choisi.

Il est impératif avant tout démarrage d’analyse de renseigner la fiche-produit et de renseigner les substances ou mélanges pouvant être potentiellement dangereux.

Le responsable de la plateforme ASIA analysera les résultats et les communiquera par courriel sous la forme de fichiers pdf (pour le rapport) et éventuellement excel (afin de traiter les données). Si les résultats prêtent lieu à publication, il sera demandé d’y associer la plateforme ASIA.


Directeur/trice

Responsable scientifique :
Jean-Michel GIRARDET
jean-michel.girardet@univ-lorraine.fr

Assistant-Ingénieur :
Franck SAULNIER
franck.saulnier@univ-lorraine.fr

Adresse

Adresse

Plateforme ASIA
Faculté des Sciences et Technologies
Campus Aiguillettes
BP 70239
54506 Vandœuvre-lès-Nancy Cedex

ASIA est située à l’entrée 3B de la FST,
au rez-de-chaussée, au fond du couloir de gauche en entrant.